作者：李文锋，张为青，罗　琛，全　松等，南方医科大学南方医院生殖中心

胚胎培养过程中微生物污染是所有体外受精（ｉｎｖｉｔｒｏ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＩＶＦ）实验室面临的严重问题。胚胎污染可能导致无可用胚胎，从而给患者带来经济和心理双重负担［１－３］ 。ＩＶＦ胚胎发生污染的概率极低，国内多个中心报道其发生率为０．２４％～０．５１％［１，４－５］， 与国外报道的ＩＶＦ周期污染发生率０．１８％～０．６８％ ［６－１０］基本一致。鉴于此，建立有效的预防和处理方案对保障ＩＶＦ成功率至关重要。

目前，含抗生素培养基洗涤是胚胎污染的常用补救措施，但其有效性常受限于细菌耐药性［４－５，１１］ 。本项研究通过使用含透明质酸酶溶液Ｇ－ＭＯＰＳ　ＰＬＵＳＴＭ（１０１３０；瑞典Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ公司）及Ｇ－１ＰＬＵＳＴＭ（１０１２８；瑞典Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ公司）处理后，成功防止了微生物的再次污染，并且最终使患者获得妊娠及活产。本研究已通过本院医学伦理委员批准（审批号：ＮＦＥＣ－２０２１－３６３）。 

１　临床资料

患者１，女，２９岁，原发性不孕４年（多囊卵巢综合征）；性激素６项检测显示卵泡刺激素（ｆｏｌｌｉｃｌｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ，ＦＳＨ）、黄体生成素（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ，ＬＨ）、雌二醇（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）和抗缪勒管激素正常。配偶精液检查无精子，精曲小管发育不全（４７，ＸＸＹ），ＦＳＨ和ＬＨ均升高，抑制素Ｂ＜１０ｐｇ／ｍＬ。经显微外科睾丸取精术后未获精子，经患者知情同意后使用供精。采用拮抗剂方案进行卵巢刺激。

精子制备和授精流程：按世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册（第５版）》评估精液标本（制备前后）的精子浓度和活力。供精解冻后，使用非连续密度梯度液（浓度为９０％和４５％，ＳｐｅｒｍＧｒａｄ；１００９９；瑞典Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ公司），４５０×ｇ离心１５ｍｉｎ。收集沉淀于Ｇ－ＩＶＦ　ＰＬＵＳＴＭ（１０１３６；瑞典Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ公司）培养基３００×ｇ离心５ｍｉｎ；沉淀０．１～０．２ｍＬ重悬于Ｇ－ＩＶＦ　ＰＬＵＳＴＭ培养基，３７℃、６％ＣＯ２培养箱中孵育上游３０ｍｉｎ。取上层悬液于０．５ｍＬ用于授精。ＩＶＦ周期精子终浓度为５．０×１０６／ｍＬ。

共获卵母细胞２２个，置于已平衡并覆盖油的Ｇ－ＩＶＦ　ＰＬＵＳ四孔皿（３５３６５４；美国ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ公司）培养３～５ｈ后，加入精子悬液。精卵共培养之前评估精子浓度和活力，授精时精子密度为每毫升１０万条／孔。卵母细胞与精子在培养基中共孵育１６～１８ｈ，１７ｈ后剥落卵母细胞并转移至已平衡并覆盖油的２５μＬ　Ｇ１培养皿（３５３６５４；美国ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ公司）中培养。评估授精情况，第１天受精结果见表１。共获１１个双原核受精卵（ｔｗｏ　ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓ，２ＰＮ）和２个单原核受精卵（ｏｎｅ　ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓ，１ＰＮ）。

受精后第２天，Ｇ－１ＰＬＵＳＴＭ培养皿中观察到不透明颗粒；高倍镜下授精精子悬液含大量不动精子及高密集性和高活动性不透明颗粒，见图１。收集胚胎培养基及授精精子悬液，密封后送微生物学检查。

检查结果显示污染菌为大肠杆菌。分离微生物进行药敏试验、抗生素耐药性检查，发现该菌对庆大霉素耐药。

制备含８０ＩＵ透明质酸酶Ｇ－ＭＯＰＳ　ＰＬＵＳＴＭ四孔皿，每个胚胎经酶溶液洗涤１５ｓ（重复２次）后，转移至平衡过的Ｇ－１ＰＬＵＳ　ＴＭ培养基中洗涤３次，再转移至另一个平衡好的Ｇ－１ＰＬＵＳ　ＴＭ培养基中继续培养。至第３天时，将１３枚可利用胚胎（４细胞及以上，评级在Ⅲ级以下）转移至Ｇ－２ＰＬＵＳＴＭ（１０１３２；瑞典Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ公司）培养基继续培养至第６天，未见再污染。移植第５天优质囊胚４ＡＢ一枚，冷冻第５天囊胚２枚、第６天囊胚２枚。本研究采用的胚胎评级标准参考《人类卵裂期胚胎及囊胚形态学评价中国专家共识》［１２］ 。移植前已充分告知患者胚胎移植风险及注意事项并获书面同意。移植后未予抗生素治疗，常规黄体支持。移植后第６周通过阴道超声确认了宫内单胎妊娠。３９＋６周剖宫产获得一女婴，体重３　８５０ｇ。

患者２，女，２９岁，原发性不孕６年。基线ＦＳＨ、ＬＨ、Ｅ２正常，配偶为克氏综合征（４７，ＸＸＹ），精液无精子（ＦＳＨ／ＬＨ升高，Ｙ染色体无微缺失），显微外科睾丸取精术后未获精子，知情同意后供精助孕，长效长方案（黄体期）促排卵，获卵母细胞２９个。

精子制备、授精及卵母细胞的剥落流程同患者１。ＩＶＦ周期精子终浓度为２．０×１０６／ｍＬ。受精结果见表１。受精后第２天，培养皿中见不透明颗粒。高倍镜下授精精子悬液含大量不动精子及高密集性和高

活动性浑浊颗粒，见图２。收集胚胎培养基及精子悬液，密封后送微生物学检查。　检查结果显示，污染菌为大肠杆菌。分离微生物进行药敏试验、抗生素耐药性检查，发现该菌对庆大霉素耐药。

使用患者１流程洗涤污染细胞。培养至第３天冷冻卵裂期胚胎２枚，余８枚可利用胚胎转移至Ｇ－２ＰＬＵＳ　Ｔ Ｍ培养基继续培养至第６天，未发现再污染。冷冻第６天囊胚３枚。移植前已充分告知患者胚胎移植的相关风险及注意事项，并获患者书面同意。第１个冻融胚胎移植（ｆｒｏｚｅｎ　ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＥＴ）周期移植优质囊胚３ＢＢ一枚，１０ｄ后验血清人绒毛膜促性腺激素０．５７ｍＩＵ／ｍＬ，未妊娠。第２个ＦＥＴ周期移植两枚卵裂期胚胎（１４ＣＩ＆７ＣＩ）。移植后６周确认宫内单胎妊娠。移植后未予抗生素治疗，常规黄体支持。４０＋１周剖宫产获得一女婴，体重３　６００ｇ。

２　讨　　论

本研究结果表明，透明质酸酶溶液洗涤可有效预防胚胎再次污染，移植后成功妊娠分娩，但仍需大样本量验证。

已有实验证据表明，液氮中存在细菌交叉污染风险［１３ ］ 。移植后剩余胚胎多采用封闭式载体冷冻，并储存于专用液氮罐中。

本研究精液均来自同一供精，受污染胚胎源于两名不同患者。两例标本微生物检测均显示大肠杆菌污染且对庆大霉素耐药，提示污染源可能为精液。供精也是污染来源之一。文献报道，供精ＩＶＦ胚胎污染发生率为１．２２％（１２／９８６）高于夫精ＩＶＦ［０．８１％（８２／１０　０６５）］［８ ］ ，但差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。

微生物污染多见于第２～４天胚胎观察期［８］ 。文献报道，污染结果与细菌类型相关：大肠杆菌污染预后较差［５，８］ ；念珠菌对胚胎发育影响较小，可用于胚胎移植［６，９］ ；巴氏葡萄球菌污染短期内对胚胎发育速度及妊娠结果无明显影响［１４］ 。

已有研究表明，移植后的种植率及活产率与胚胎的评级相关，囊胚的内细胞团和滋养层细胞评级与妊娠率和活产率呈正相关［１５］ 。本研究两个供精ＩＶＦ周期污染胚胎均发育为囊胚并成功妊娠分娩。该结果可能源于细胞冷冻解冻过程中微生物增殖活性降低，或透明质酸酶溶液洗涤对该微生物效果明显，仍需进一步验证。

细菌增殖不仅与胚胎竞争营养物质，其产生的内毒素还可引发胚胎碎裂、气泡形成及妊娠率降低［１６－１７］ 。使用含抗生素培养基洗涤污染胚胎也许可清除其表面微生物。张敏等［１８］ 和罗清炳等［１９］ 研究中使用商品化培养液反复冲洗污染胚胎，但无法完全避免再污染。研究表明，洗涤液中加入外源性青霉素、链霉素（０．１５ｍｇ／ｍＬ）或庆大霉素（０．１５ｇ／Ｌ）可抑制细菌生长［１８，２０］ 。但该方法可能并非最优解，抗生素洗涤后仍有胚胎再污染的可能［４－５，１０］ ，原因可能为以下两个方面：培养基细菌浓度过高，或细菌对所用抗生素耐药［８］ 。因细菌培养及药敏试验需数天获取结果，临床中研究者只能主观选择抗生素应急处理污染胚胎。

人透明带（ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａ，ＺＰ）主要由４种糖蛋白（ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３和ＺＰ４）组成。其外表面是由相互连接的细丝组成的规则孔隙网络结构［２１－２２］ ，且外表面孔径大于内表面［２３］ ，易致微生物黏附，导致单纯含抗生素洗涤液难以清除ＺＰ表面的微生物。

古米娜·卡米力等［２４］ 通过台式酸去除胚胎透明带以阻断再污染，效果明显。ＳＨＵ等［１０］ 和ＬＩ等［１１］亦报道使用该方法获得妊娠及活产的报告。但台式酸操作时间过长可能损伤卵膜或者卵裂球胞质膜，影响胚胎发育。ＺＰ在受精和植入前对胚胎发育至关重要，在胚胎卵裂球致密化前维持胚胎空间结构［２１］ ，限 制卵裂球分离及外部干扰。因此，胚胎早期发育阶段去除透明带预防再污染并非最优选择。

人透明质酸酶是卵质内单精子注射（ｉｎｔｒａｃｙｔｏ－ｐｌａｓｍｉｃ　ｓｐｅｒｍ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＩＣＳＩ）操作前卵母细胞剥除卵丘颗粒细胞的常用酶，其安全性和有效性已获广泛认可［２５－２８］ 。ＢＵＲＥＡＵ等［２９］ 研究发现，使用透明质酸酶溶液洗涤能有效清除所有测试的病毒。尽管透明质酸酶似乎没有抗菌作用［８］ ，但考虑到其安全性和有效性，本研究仍使用透明质酸酶及商品化培养液来处理受污染的胚胎。除精子梯度分离液外，其余培养液均含庆大霉素。受污染胚胎先以含透明质酸酶的溶液快速冲洗，再经培养基洗涤。该方案在除菌同时，可降低高浓度抗生素长期暴露对胚胎发育的潜在抑制［３０］ 。

因微生物增殖需要一段时间才能达到稳定期，应急处理后需延长培养时间以评估污染风险。洗涤后的胚胎不建议进行卵裂期胚胎移植及冷冻；对有胚胎污染史的患者，后续治疗周期应直接采用ＩＣＳＩ授精方式。ＩＣＳＩ是一种无需额外预防措施即可预防胚胎污染的方法［１，８，３１］ 。其预防污染的机制，主要有以下两个方面：一是卵母细胞脱除颗粒细胞时经透明质酸酶消化及反复洗涤后降低卵源性污染；二是授精时选取单个精子进行显微注射，将其与白细胞、细菌等分离，进而降低污染的可能性。

利用透明质酸酶溶液处理胚胎污染是ＩＶＦ胚胎污染后补救处理的有效方法。经处理的胚胎可实现着床并获得活产，且妊娠期内未发生宫内感染。但对曾受细菌污染的胚胎移植需谨慎，其远期影响尚不明确，需前瞻性研究验证其用于移植的有效性和安全性。

参考文献略。

来源：李文锋,张为青,罗琛,等.透明质酸酶处理污染胚胎后获得正常活产2例报道[J].重庆医学,2025,54(12):2955-2960.